分子生物學技術的又一次進階

Nature報道了一項新的技術——新型核糖體，通過控制細胞合成蛋白質的過程，讓人們更好地理解蛋白質的合成過程。

核糖體是一種細胞器，細胞利用核糖體轉錄mRNA的信息，從而將氨基酸翻譯成蛋白質。試想，如果核糖體被改造，將會發(fā)生什么？伊利諾斯大學生化學家AlexanderMankin與西北大學生化學家Michel Jewett 聯(lián)手制造出新型核糖體，并且這種核糖體zui大的優(yōu)勢在于可以根據需要改變其原有的工作方式。

每個核糖體都是大、小兩個亞基組成的不規(guī)則顆粒，不同的大小亞基有多種結合方式，其可變性也很高。兩位學者根據這種大小亞基結合的多變性，通過RNA將大小亞基連接。經過長時間的研究發(fā)現(xiàn)，這種通過RNA將大小亞基結合的結構可以在細胞內穩(wěn)定存在數(shù)月，并且這種核糖體亞基能夠維持細菌緩慢生長，證明這種合成的核糖體亞基與天然的核糖體可并行發(fā)揮作用。

這一發(fā)現(xiàn)開啟了分子生物學的新紀元，在未來或許可以制造出新型的抗生素。

WesternBlot操作

1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation) 
      使用適當?shù)牧呀庖毫呀赓N壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進行抽提。

需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒。
2. 電泳(Electrophoresis) 
(1) SDS-PAGE凝膠配制 
      SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制，也可以使用 SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。 
(2) 樣品處理 
      在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。92℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。 
(3) 上樣與電泳 
     冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。  
     電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然后設定定時時間為90－120分鐘。設置定時可以避免經常發(fā)生的電泳過頭。
     通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳。
3. 轉膜(Transfer) 
     我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜(FFP36/FFP39)。硝酸纖維素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產商的推薦使用步驟。 
     通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，可以設定轉膜電流為300-400mA，轉膜時間為30-60分鐘。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。
     在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發(fā)熱現(xiàn)象，把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。 
     轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進行染色，以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液(P0017)對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。 
4. 封閉(Blocking) 
     轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產生較高的背景。 
     加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以4℃封閉過夜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 
     參考一抗的說明書，按照適當比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。 
洗凈封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜。或更據抗體的說明選擇適當?shù)姆跤郎囟群蜁r間。
     回收一抗。加入Western洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。洗凈洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。 
 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 
     參考二抗的說明書，按照適當比例用Western二抗稀釋液稀釋熒光標記的二抗。 二抗需根據一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)。洗凈洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。 
     回收二抗。加入Western洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。

7、熒光顯微鏡下觀察熒光