NGS測(cè)序之文庫構(gòu)建

一、文庫構(gòu)建的步驟

文庫構(gòu)建大致步驟類似，但是各有各自du特的點(diǎn)，例如，RNAseq里miRNA，lncRNA，mRNA方法各有差異，具體方法以后有機(jī)會(huì)再補(bǔ)充。這里以Illumina的 PE文庫為例，其流程圖如下圖。

二、文庫構(gòu)建詳細(xì)步驟

（1）DNA片段化 （Fragment DNA）

使用超聲、酶或者加熱的方式將DNA樣品打碎成小片段，一般在300 ~ 800bp之間除非有特殊要求。

（2）末端修復(fù)（End Repair）

補(bǔ)平片段化時(shí)導(dǎo)致的不平末端。

（3）3' 末端加“A" （A-tailing）

3‘ 末端加A，轉(zhuǎn)換為粘性末端，與adapter 互補(bǔ)配對(duì)，因?yàn)?/span>adapter 3‘端有一個(gè)突出的T。

（4）接頭連接（ ligation adaptor）

這一步有兩種不同的添加策略如下圖。

左邊的圖是直接在fragment DNA的兩端直接加上full Y-adapter, adapter中已經(jīng)包括了和P5/P7 oligo互補(bǔ)的序列, index, 以及Read1/Read2的測(cè)序引物。

右邊的圖是先在fragment DNA的兩端加上PE adapter, 然后再引入和P5/P7 oligo互補(bǔ)配對(duì)的序列以及index序列，分兩步：

A. PE adapter添加利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，加上PE adapter。PE adpater中一部分是建庫PCR富集時(shí)候需要用的引物序列，另一部分是測(cè)序時(shí)需要用的引物。

B.PCR 添加 index，P5，P7

Index也稱barcode，用來區(qū)分不同樣本的文庫，因?yàn)闇y(cè)序儀一個(gè)lane產(chǎn)生數(shù)據(jù)量若干Gb，為了最da化利用測(cè)序儀，一次上機(jī)常會(huì)進(jìn)行多個(gè)樣本文庫混合測(cè)序，在后續(xù)分析時(shí)，Index用來區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)是來自哪個(gè)樣本。

      ● PCR富集目的片段

進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)與投入的DNA量有關(guān)，使得文庫達(dá)到上機(jī)濃度。

● 擴(kuò)增文庫大小質(zhì)檢

使用Agilent 2100對(duì)文庫的insert size進(jìn)行檢測(cè)。

● 文庫濃度定量

Qubit3.0 進(jìn)行初步定量 Q-PCR對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，至此文庫構(gòu)建結(jié)束。

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