小鼠腦組織解離試劑盒使用方法

百奧益康小鼠腦組織解離試劑盒（貨號：BA3305）適用于小鼠腦組織的細胞懸液的分離制備，本產品利用酶溫和、快速有效地破壞細胞外基質，釋放細胞，從而生成單細胞懸浮液。制備的單細胞懸液可用于單細胞測序、細胞培養(yǎng)或其他細胞相關檢測。百奧益康小鼠腦組織解離試劑盒（貨號：BA3305）怎么使用呢？讓我們一起來看看小鼠腦組織解離試劑盒的使用方法吧！

一、材料準備

1. 儀器：水浴鍋（定期手動搖晃混勻）或雜交爐（轉速 20 ~ 30 轉/分鐘）、水平離心機。

2. 試劑：PBS、FBS、RPMI 1640 培養(yǎng)基。

3. 耗材：低吸附槍頭、離心管、20 μm 和 70 μm 的細胞篩。

二、操作步驟

準備工作：水浴鍋或雜交爐設置到 37℃、配制含 5% FBS 的 PBS。 切取新鮮組織約 200 mg（黃豆粒小），如圖 1。

圖1 新鮮組織樣圖

1. 取一個5 mL 離心管，加入2160 μL Buffer A，放入用PBS 清洗干凈的組織樣本，并剪碎。

2. 添加800 μL 的 Enzyme B 和10 μL 的Enzyme C，顛倒混勻。

3. 放在37℃水浴鍋或雜交爐中20 ~ 30 min。消化過程中，使用水浴鍋每隔3 ~ 5 min 手動搖晃混勻。使用雜交爐轉速20 ~ 30 轉/分鐘左右。

4. 每隔3 ~ 5 min 質檢一次細胞懸液，根據細胞總量及活性等確定消化停止時間。

5. 消化完成后，用70 μm 細胞篩進行過濾，收集濾液于新的15 mL 離心管中。

6. 加3 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基或 5% FBS 的PBS 于消化的離心管中，上下顛倒涮洗管壁，涮洗液同樣經過同一個70 μm 細胞篩進行過濾，收集濾液于第5 步的15 mL 離心管中。

7. 將收集液于4℃，300 ×g 離心5 min，棄上清。

8. 用5 mL 含5% FBS 的PBS 重懸沉淀，吹打混勻。

9. 放入水平離心機，4℃，300 ×g 離心5 min，棄上清。

10. 用含5% FBS 的PBS 重懸沉淀至2 mL。

11. 加入1 mL DRS（細胞碎片去除緩沖液），用5 mL 移液器緩慢吹打混勻10 次。不要渦旋振蕩。

12.沿管壁緩慢加入3 mL PBS，輕輕覆蓋在最上層，千萬不要混勻，如圖2。

        圖2                                                                 圖3

13. 務必使用水平離心機，并設置為居中的加速度和減速度，4°C，3000 ×g，離心20 min。

14. 離心后，緩慢取出離心管。溶液分成3 層。緩慢吸出全部上清液（優(yōu)先吸出碎片層），保留細胞沉淀（上清盡量wan-quan去除干凈），如圖3 和圖4。

注：離心管要輕拿輕放，確保分層明顯，不同層的溶液間不互相混合。

圖 4 小鼠腦細胞碎片去除示意圖

15. 向沉淀中加入適當體積的含5% FBS 的PBS，加入三倍體積的紅細胞裂解液（BA3311），冰上裂紅5 min。具體可以參考BA3311 紅細胞裂解液說明書。

16. 加入等體積的PBS 混勻，終止裂紅，4°C，450 ×g，離心5 min，棄上清。

17. 用10 mL 含5% FBS 的PBS 重懸沉淀，吹打混勻，4℃，300 ×g 離心5 min，棄上清。

18. 用50 µL ~ 2 mL 含5% FBS 的PBS 重懸沉淀，根據所需的細胞濃度調整重懸液的體積。

19. 若有明顯細胞結團，則使用20 μm 細胞篩進行過濾，收集濾液于新的離心管中。若無明顯細胞結團，則可跳過此步驟。

20. 用細胞計數儀對細胞懸液進行質控并記錄。質控結束后請立即進行后續(xù)實驗。

在使用的過程中，請按照百奧益康小鼠腦組織解離試劑盒（貨號：BA3305）的使用方法來進行使用，若有任何問題，請聯系百奧益康試劑盒代理——北京百奧創(chuàng)新科技有限公司！